Certains biographes défenseurs de l'explorateur clamèrent l'innocence de ce père, ce qui n'a pas été avéré. En revanche, la plupart des biographes posent la volonté de redorer le blason familial comme l'un des motifs du voyage de Caillié. Il ne connaît pourtant pas son père qui meurt au bagne de Rochefort en 1808. À onze ans, il devient orphelin : sa mère meurt en 1811. Fasciné par la lecture de Robinson Crusoé de Daniel Defoe, il quitte Mauzé à l'âge de dix-sept ans, à pied, pour Rochefort.
Désirant parcourir des terres inconnues, il quitte la France en 1816, mais ne réalise son rêve que onze ans plus tard. Il connaît d'abord deux échecs, doit revenir en France. Enfin, ils se rend chez les Maures braknas, dans l'actuelle Mauritanie, d'août 1824 à mai 1825, pour apprendre la langue arabe et la religion musulmane. Il s'invente une nouvelle identité de musulman, qu'il endossera durant son voyage pour éviter de se faire tuer. Après avoir appris l'existence du prix qu'offrirait la Société de géographie au premier Européen qui pénètrerait dans la ville de Tombouctou rendue mythique par les récits des voyageurs arabes du Moyen Âge et interdite aux chrétiens, il décide de partir, seul, par ses propres moyens, sans aide financière, sans escorte militaire, se faisant passer pour un humble lettré musulman. Parti de Boké en Guinée, il est retenu cinq mois — gravement atteint du scorbut — à Timé dans l'actuelle Côte d'Ivoire. Enfin, il atteint le 20 avril 1828, Tombouctou, il est déçu de trouver une cité tombant quelque peu en ruines, c'est finalement Fès qu'il qualifie de « la ville la plus belle qu'[il ait] vue en Afrique ».
Son retour en France en 1830 après seize ans d'absence, à travers le désert du Sahara puis le Maroc est un véritable calvaire. Il reçoit de la Société de Géographie un prix de 10 000 francs, ainsi que le Grand Prix des explorations et voyages de découvertes, partagé symboliquement avec le major Alexander Gordon Laing.
Il publie en 1830 son Journal d'un voyage à Tomboctou et à Jenné dans l'Afrique centrale, avec le concours d'Edme François Jomard, qui lui assurera une grande renommée. Les Anglais ont contesté la véracité de ses écrits et de son voyage
Les attaques de ses détracteurs lui sont très pénibles, il clôt ainsi son journal : « Quoi qu'il en soit, j'avouerai que ces injustes attaques me furent plus sensibles que les maux, les fatigues et les privations que j'avais éprouvés dans l'intérieur de l'Afrique » Mais ses écrits sur Tombouctou seront confirmés par le voyageur allemand Heinrich Barth en 1858, encore que ce dernier soit très critique vis-à-vis de la qualité des observations de Caillié.
Si ce dernier écrit à son arrivée en France « Ceux qui ont été longtemps absents de leur pays, et qui ont pu craindre de ne jamais y rentrer, ceux-là peuvent se faire une idée de ce que j'éprouvai en revoyant cette chère patrie ! », une fois que le public l'a oublié, il semble s'ennuyer vivant sur son domaine de La Baderre (devenu l'Abadaire) sur la commune de Champagne dont il est devenu le maire. Il rêve de partir une nouvelle fois en Afrique. Il meurt sur ses terres le 17 mai 1838, usé par son périple, des suites d'une maladie contractée en Afrique.
Le voyage de René Caillié a été interprété de différentes façons. Jules Verne le qualifie du « plus intrépide voyageur des temps modernes » Il est admiré comme ouvreur de l'empire colonial français africain à la fin du XIXe siècle et au début du XXe siècle ; ainsi, en 1885, ses biographes E. Goepp et E. Cordier écrivent ceci :
« [René Caillié] a été le précurseur des grandes choses qui, plus de cinquante ans après lui, s'accomplissent sous nos yeux. Il n'a pas créé de mer, ni percé d'isthme ; mais il a tracé une route, et cette route que durant de longs mois il a cheminée douloureusement aux prix de fatigues inouïes, voilà que déjà nous pouvons prévoir le jour, où sillonnée par des machines à vapeur, elle nous livrera toutes les richesses de l'Afrique centrale. »
Il a été plus récemment considéré comme le premier « africaniste » : respectueux des hommes et civilisations qu'il a rencontrés, il dénonce l'esclavage et la condition des femmes.
Son récit de voyage constitue une peinture minutieuse « des paysages naturels et culturels rencontrés » : de la géographie de pays traversés, de sa faune et de sa flore, des mœurs des populations rencontrées, etc.
Sa ville natale, Mauzé-sur-le-Mignon, organise chaque année la Fête à Caillié et le Festival de l'Aventure individuelle où est décerné le prix René Caillié des écrits de voyages. Quoiqu'il ne soit plus très connu en France ailleurs que dans sa région natale, l'explorateur reste connu et étudié dans trois des pays qu'il a traversé : la Guinée, la Côte d'Ivoire et le Mali.
